应用浓缩生长因子促进干细胞增殖及成骨分化修复口腔颌面部缺损的研究进展

由创伤、感染、先天畸形、肿瘤等原因引起的口腔颌面部软硬组织缺损，不但影响患者的咀嚼、发音等功能，而且不利于美观，严重影响其身心健康。学者们尝试自体骨及多种骨替代材料修复缺损部位，自体骨移植常受供区尺寸限制，伴发疼痛、感染、神经损伤等并发症；而单一骨替代材料则普遍存在塑形性差、成骨速度慢等缺点。

    骨组织工程和再生医学通过将干细胞或生长因子加载到支架材料上，使颌面部缺损重建成为可能。浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF）是最新一代血小板浓缩物，含有多种自体骨诱导性生长因子，单独应用或联合其他骨移植材料已广泛应用于修复口腔颌面部软硬组织缺损。干细胞是具有自我复制能力的多潜能细胞，特定条件下可分化为多种功能细胞，是再生医学的核心组成部分。

    CGF可诱导干细胞增殖并分化为成骨细胞，进而激活成骨细胞并增强血管生成，引导新骨形成。基于此，学者们认为应用CGF联合干细胞疗法在口腔颌面部缺损修复领域具有广泛的应用前景。

   1.CGF发展历史

    目前，自体血小板浓缩物已发展至第三代。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是采用双重离心技术从自体全血中提取的第一代血小板浓缩物，含有丰富的生长因子；但PRP制备过程繁琐，需添加外源性凝血酶才可释放生长因子，且生长因子作用时间短暂。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是采用单次离心法从自体全血中提取的第二代血小板浓缩物，制备方法简单，无需添加凝血酶即可释放生长因子且生长因子持续时间更长。

    CGF是专用离心机（Medifuge，Silfradentsrl，意大利）以2400~3000r/min的转速交替变化离心自体静脉血制备出的第三代血小板浓缩物，不但保留了PRF的优点，而且能够分离出比PRP和PRF更大、更密集的纤维蛋白基质；CGF植入缺损部位后不会迅速溶解，而是以类似于天然血凝块的方式进行缓慢重塑，因此，生长因子作用时间延长。此外，CGF较之PRP和PRF具有较高的强度和黏度，可更好地保护生长因子免于蛋白水解。

    2.CGF主要成分及作用

    CGF主要成分为多种生长因子、CD34阳性细胞、血小板、白细胞及纤维蛋白原所形成的纤维网状支架。CGF包含多种已知对骨骼再生至关重要的生长因子，如血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）。

    PDGF是高效的促有丝分裂因子、多种细胞的强效吸引剂，能够维持新生血管的稳定性，促进干细胞的成骨分化，被认为是组织修复与再生的关键调节因子。TGF-β是一种分泌蛋白，具有良好的生物活性和多种调节功能，能够激活软骨形成及干细胞成骨分化，在骨愈合过程的早期和中期起关键作用。

    TGF-β1是TGF-β最丰富的亚型，其主要功能是促进前体成骨细胞趋化并促进纤维细胞分泌纤维黏蛋白和胶原蛋白，调节骨细胞生长、免疫和分化。VEGF作为血管活性分子，是细胞外基质重塑和血管生成的重要协调者，参与初始血管舒张，增强血管内皮细胞通透性，重建血管周围基质，诱导内皮细胞的增殖和迁移等过程。

    IGF由骨细胞产生，是生理性骨折愈合和成骨细胞成熟的重要标志，在骨基质的生长、分化和代谢过程中发挥关键作用。FGF在特定条件下起成骨促进剂的作用，其中FGF2和FGF9能够诱导成骨细胞的增殖及血管生成，FGF18可促进成骨细胞分化。这些生长因子在发挥自身功能的同时也具有协同作用，并建立了紧密接触的组织修复调节系统，促进软硬组织再生。

    CGF中含有大量CD34阳性细胞，在维持血管形态、促进新血管生成中发挥重要作用。CGF中捕获的血小板和白细胞能够释放趋化因子，从而促进细胞募集。CGF具有纤维蛋白基质形成的三维支架结构，富有弹性和渗透性，可作为生长因子的储库，这种致密的纤维蛋白网络不仅为细胞的黏附与迁移提供了基质表面，而且保护了活性分子免于蛋白水解。

    3.CGF在口腔颌面部缺损修复领域对干细胞增殖及成骨分化的作用

    3.1CGF在牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）增殖及成骨分化过程中的作用

    2004年，Seo教授首次分离出PDLSCs，是牙周组织再生最直接可靠的种子细胞，具有多向分化潜能且易于分离纯化，但短期内很难获得充足牙周组织再生所需的细胞量，PDLSCs经过多次传代后难以诱导分化，因此如何高效扩增PDLSCs成为研究热点。Yu等将CGF与PDLSCs共培养发现，CGF能显著促进PDLSCs增殖，上调碱性磷酸酶活性、矿化结节数量及特定蛋白的表达量，而且以剂量依赖性和时间依赖性方式促进了PDLSCs活化及分化。

    贾婷婷将PDLSCs分别接种于CGF膜、海奥膜及空白孔板表面，3~5d后CGF膜表面细胞数量远高于海奥膜及空白对照组；对3组细胞成骨诱导7d后，CGF膜组的成骨相关mRNA及成骨相关蛋白表达量高于海奥膜及空白对照组，提示CGF与成骨诱导条件联合应用时可显著促进PDLSCs成骨分化。骨稳态从根本上受Wnt信号通路调控，Qiao等发现CGF处理的PDLSCs中Wnt3amRNA表达随时间增加，表明Wnt/β-catenin信号通路参与了CGF诱导PDLSCs早期增殖和分化过程。

    3.2CGF在牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）增殖及成骨分化过程中的作用

    牙髓是疏松的结缔组织，具有一定修复与再生能力，轻微的炎症可刺激留存于牙髓中的DPSCs迁移至损伤部位，继而分化为成牙本质细胞并参与修复牙本质-牙髓复合体。因此，如何在炎性微环境下促进牙髓组织再生成为研究热点。Xu等将DPSCs分别与CGF、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及CGF+LPS共培养，3d后CGF+LPS组的增殖、迁移细胞数量显著高于CGF组和LPS组，7d后CGF+LPS组hDPSCs的碱性磷酸酶活性增加，21d后CGF+LPS组矿化结节数量和成骨相关基因的表达显著高于其他两组。同时进行的动物实验发现CGF可促进比格犬未成熟牙齿的牙本质-牙髓复合体的再生，初步认为CGF可能是牙髓再生治疗中的替代生物材料。

    杜楠进而证实CGF促进DPSCs成牙、成骨分化在一定范围内呈现浓度依赖性。Jin等通过扫描电镜观察到CGF的多孔纤维蛋白网络结构，体外实验研究发现，高浓度CGF刺激细胞增殖，而低浓度CGF促进DPSCs介导的牙本质生成和血管生成过程。

    3.3CGF在人骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖及成骨分化过程中的作用

    BMSCs是能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等的多能细胞，常作为骨组织工程的种子细胞。Honda等率先进行了大鼠颅骨缺损的骨组织再生实验，CGF与BMSCs联合治疗法在术后12周完全修复骨缺损部位，在体外研究中，CGF以剂量依赖性的方式促进BMSCs的增殖及成骨分化。进而，Chen等证实CGF联合BMSCs在骨缺损修复中的独特优势，CT和组织学证实术后6周骨缺损的周围及中心均出现了新生骨，并发现CGF联合BMSCs在刺激血管生成方面也优于胶原蛋白。

    狄婧研究发现，CGF能明显促进BMSCs的早期增殖，加强成骨诱导培养基的成骨诱导能力。柳逸博等研究发现，CGF联合1，25二羟基维生素D3的应用亦可促进大鼠BMSCs的增殖，并促进其成骨分化。以上研究结果表明，CGF与BMSCs的联合应用具有骨组织工程的必要特征（骨生成细胞——BMSCs、骨诱导支架——纤维蛋白基质、骨传导性生长因子——血小板生长因子），CGF不仅为BMSCs提供了三维纤维蛋白支架结构，而且释放多种生长因子，这些因子通过特定的受体调节BMSCs的增殖及成骨分化。

    3.4CGF在脂肪干细胞（adipose-derived pulp stem cells，ADSCs）增殖及成骨分化过程中的作用

    ADSCs存在于脂肪组织，于2001年被发现具有类似于BMSCs的生物学特性及成骨分化性能，且ADSCs具有来源广泛、易于分离培养、再生性能强等优势。王超等将CGF与ADSCs置于凝胶海绵表面用于修复大鼠全层皮肤缺损，结果表明，添加CGF与ADSCs的凝胶海绵组创口愈合时间显著短于单纯海绵组及单纯包扎组，且炎症反应较轻。

    马翔宇等进一步探讨CGF对ADSCs成骨作用影响，将CGF与ADSCs体外共培养，实验组成骨指标表达量均显著高于对照组，证实CGF可明显促进ADSCs体外增殖及骨向分化。

    4.总结与展望

    CGF取材于自体静脉血，来源广泛，制备方法简单，全过程无任何添加，避免传染性和过敏性疾病的发生，并且CGF富含组织愈合所需的多种生长因子，具有柔软、纤薄、有弹性的纤维蛋白网格结构，被认为是良好的自体生物材料，表现出高效促进软硬组织再生修复的能力，在口腔临床医学领域的应用越来越广泛。

    修复口腔颌面部组织缺损是临床较难解决的问题之一，骨组织工程是修复组织缺损的重要手段，理想的种子细胞则是骨组织工程的必要条件。成体干细胞能够自我更新并具有一定多向分化潜能，特定条件下，干细胞可分化为功能细胞，参与组织修复过程。干细胞及生物材料的组合在口腔颌面部缺损修复领域的研究与应用取得了飞速发展。鉴于CGF的独特自身优势，学者们探索了CGF对干细胞分化特性的作用，证实CGF可促进多种干细胞增殖及成骨分化，认为两者的联合应用可作为修复口腔颌面部缺损的新型治疗方式。

    CGF与干细胞联合疗法的开展面临以下问题：CGF中各生长因子的具体比例、促进组织再生的分子生物学机制尚不清楚；CGF与干细胞联合应用的研究目前主要局限于体外研究，缺乏大量动物实验辅证，其远期应用效果也缺乏追踪报道。鉴于CGF的独特自身优势，需开展更为深入的研究，以加快CGF与干细胞联合疗法在口腔颌面部缺损修复领域及其他医学领域的应用。

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