浓缩生长因子在牙髓组织再生中的应用研究

全世界约有三分之二人口患有龋病和/或牙髓炎。目前，牙髓坏死和根尖周病的治疗为根管治疗和根尖外科手术，但根管治疗后牙齿因为缺乏营养来源而导致牙齿变脆易折。近年来，随着牙髓组织工程的发展，牙髓再生成为牙髓病治疗领域新的突破口及研究趋势。再生牙髓治疗（RET）的目的是用新生的类牙髓样组织取代炎症状态或已坏死的牙髓组织，从而尽可能地保持牙齿活力，使未成熟的牙齿继续发育。

    牙髓组织再生有三个必备要素，即具有分化潜能的干细胞、生长分化信号因子、生物活性支架材料。近年来，有学者提出浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF）作为更为理想的支架材料用于牙髓再生，并进行大量的研究。

    1.浓缩生长因子的发展

    血小板浓缩物来源于自身富含自体生长因子的一种自体纤维蛋白物，具有制备简单、经济划算、生物安全性高、有再生潜能等优势。目前主要包括三类：富血小板血浆（PRP）、富血小板纤维蛋白（PRF）和浓缩生长因子（CGF）。

    富血小板血浆作为第一代血小板浓缩物最早于20世纪80年代初期发现，研究发现它在早期（在前8h内）释放所含有的大量生长因子，对组织的修复有促进作用。因其制备过程中要加入抗凝剂和凝血酶，所以可能存在伴发凝血系统紊乱的风险。

    富血小板纤维蛋白作为第二代血小板浓缩物，不需要额外加入抗凝剂，静脉血经离心后即可获得。与PRP相比，PRF含有大量白细胞，增加了抗感染能力和免疫调节作用。PRF中纤维蛋白呈现三维立体网状结构，可保护血小板不被立即活化，生长因子可随时间缓慢释放，这种释放方式对于组织再生是非常有利的。

    CGF是2006年Sacco等首次发现，是继富血小板血浆（platelet rich plasma）和富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin）之后的第三代血小板浓缩物。浓缩生长因子由一种特殊的变速离心机Medifuge（Silfradent，意大利）对静脉血进行离心，离心过程中血小板发生碰撞被激活，破裂后释放密集、丰富的生长因子。

    与PRF制备相同，浓缩生长因子制备也不需要加入凝血酶和抗凝剂，两者的离心速度不同，其结构也不相同。有学者对CGF和PRF结构上的差异进行比较，发现两者形态相似，均为淡黄色块状物；但两者的胶原纤维排列不同，PRF中胶原纤维排列成条索状，而CGF中胶原纤维排列成栅栏状；但浓缩生长因子中转化生长因子（TGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素样生长因子和血管内皮生长因子的含量均高于血小板纤维蛋白。

    2.浓缩生长因子的制备及成分

    采集患者静脉血到未添加抗凝剂的9mL无菌Vacuette试管中（试管内不含有抗凝剂等任何添加剂），勿晃动（避免产生溶血反应），立即放入Medifuge离心机，变速离心12min。静脉血经离心后，Vacuette管内成分分成3层：最上层是一种透明液体，即血清，是由没有纤维蛋白原和凝血因子的血浆组成。中间层呈黄色不透明凝胶状，为CGF，这一层由大而致密的聚合纤维蛋白块、聚集的血小板和大量生长因子组成。底层主要由红细胞构成，呈暗红色致密凝胶状。CGF是通过切断红色的致密凝胶，然后将其压缩成一层薄膜来机械分离的中间为纤维蛋白凝胶（CGF的主要载体），下层为红细胞层。

    上层血清可进行存储并用于预防创口感染及促进伤口的愈合，红细胞层的上面和纤维蛋白层的下面存在大量的生长因子和干细胞，所以分离CGF层时应一并分离出来，并存储在抗菌溶液中（Lincocin600mg），剩余的红细胞层可用于制备植骨术中的填料。

    3.CGF在牙髓再生中的应用

    3.1　生长因子的释放　

    CGF因特殊的离心速度，使血小板破裂后释放大量生长因子和细胞因子，如转化生长因子（transforming growth factor TGF）、类胰岛素样生长因子（IGF）、血小板衍生生长因子（（platelet derived growth factor，PDGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、骨形态发生蛋白等（bone morphogenetic protein，BMP）等。这些细胞因子与细胞的分化、增殖和血管生成的调控过程紧密相关，且调控过程对组织再生至关重要。

    多项研究表明，细胞因子在牙髓再生中促进具有分化潜能的干细胞成牙本质向分化。有学者证实BMP-7、TGF-β与一定浓度IGF-1相联合可促进牙髓干细胞成牙向分化。同样，Zhang等证明PDGF-BB可增强人牙髓干细胞的增殖、迁移和成牙向分化能力，且促进牙髓干细胞VEGF的分泌，增加牙髓血管再生潜能。He等证实FGF可明显促进牙髓干细胞的增殖，可协同TGF-β1诱导牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化。

    血管生成是形成新血管的细胞过程，这一复杂的分子机制需要多种生长因子进行协同作用。浓缩生长因子含有大量血管再生相关因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维生长因子（FGF）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor）等，这些血管相关细胞因子在牙髓再生和修复中发挥重要作用。多向研究指出VEGE和FGF能够促进牙髓新生血管的再生。但牙髓再生中干细胞的增殖和多向分化不是单一因素所导致，需要多种细胞因子相互作用。

    CGF胶原基质中粗细胶原纤维形成三维网状立体结构，该结构可以保护生长因子避免被蛋白水解酶水解，保持纤维网络中生长因子的浓度和持续缓慢的释放，并促进牙髓组织的形成。同时，CGF的三维网状结构可作为支架支撑新形成的组织，促进细胞的附着，为牙髓再生提供有利环境。

    3.2　CGF在牙髓再生中的体外研究　

    有学者模拟炎症微环境对牙髓再生进行研究发现，在有无LPS处理的情况下，CGF均能显著促进牙髓干细胞的迁移；LPS感染牙髓干细胞后再经CGF处理发现ALP活性增加，成牙相关基因和成骨相关基因，如DSPP、DMP-1、Runx2、OPN和OCN表达增高，这些结果表明，CGF能明显促进lps刺激的牙髓干细胞成牙本质/成骨分化。Hong等将CGF制成CGF条件培养基（CCM）对人根尖乳头干细胞进行培养，证实CGF组矿化结节更大更多，成骨/成牙本质相关基因如ALP、DMP-1和DSPP在14天时表达量上调显著，表明CGF可显著促进人根尖乳头干细胞（SCAPs）成牙本质向分化。

    Chen等发现CGF显著促进牙龈间充质干细胞增殖，且可能通过调节DSPP、DMP1、BMP2和RUNx2的表达促进GMSCs细胞的成骨/成牙本质分化。Qin等发现CGF能促进施万细胞增殖及迁移，且能促进施万细胞分泌神经营养因子，且体外可促进损伤后神经功能的恢复。CGF显著促进牙周膜干细胞的增殖和分化，表明有利于牙周组织的再生。

    宦俊等证明了体外条件下CGF可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和表达成血管相关因子，证明了CGF可明显促进血管新生，为今后CGF在牙髓血运重建中奠定了基础，提示CGF在牙髓血运重建中具有潜在应用前景。Zhang经体外实验发现CGF纤维蛋白网络中散在分布CD-34阳性细胞，这与Rodella等发现一致；同时经CGF处理后兔骨膜来源细胞的VEGF和bFGF表达升高，表明CGF具有促进血管新生潜能。

    3.3　CGF在牙髓再生中体内研究　

    Zhang等将PDGF-BB修饰的人牙髓干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下，发现有新生牙本质和类牙本质样细胞的产生。有学者将比格犬未发育完全的年轻恒牙牙髓拔除，并进行清理消毒，然后将比格犬自体浓缩生长因子制成2mm3大小充填到根管内，结果表明，比格犬年轻恒牙牙本质壁增厚、根管内出现类牙髓组织和栅栏状排列的成牙本质细胞和散在的血管。有学者将PRF复合牙髓干细胞置于根管内放入裸鼠皮下，观察到根管内有明显致密的新生血管形成，类似于正常牙髓组织，并有新生的类牙本质及类成牙本质细胞分布于根管内壁，且DSPP阳性表达，这表明血小板浓缩物具有促牙髓牙本质再生能力。

    4.展望

    CGF作为最新一代血小板浓缩物，制备简单，不需要任何额外的合成材料或生物材料（如牛凝血酶或氯化钙），不存在交叉污染的风险。浓缩生长因子使用自体血制备，临床应用安全性高，创伤小，且胶原纤维中含有大量血小板生长因子，释放缓慢，作为牙髓再生的支架材料应用前景广阔。多项体外临床前期研究证实浓缩生长因子在组织再生方面的能力，目前已广泛应用于口腔、颌面、整形、骨外科以及牙龈组织工程研究。CGF在骨再生中使用方式多样，可压制成膜也可制成颗粒与自体骨或异体骨粉联合使用，在促进伤口愈合、种植体骨结合和上颌窦提升方面效果显著，但CGF用于牙髓再生的临床应用较少，还有待于进一步研究。

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